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Segundo periodo, de lenta acumulación de observaciones (desde 1675 aproximadamente hasta la mitad del siglo XIX), que arranca con el descubrimiento de los microorganismos por Leeuwenhoek (1675). -
El cultivo de microrganismos en el laboratorio no siempre fue tarea sencilla. Hacia 1800, los primeros bacteriólogos cultivaban los microorganismos en alimentos como la patata, las claras de huevo coaguladas y la carne. Esta técnica parecía funcionar e incluso más adelante, los experimentos permitían transferir los microorganismos a los medios frescos una y otra vez.
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En 1860 adscribe inequívocamente la fermentación alcohólica a ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus Études sur le vin resume sus hallazgos al respecto, inaugurando la Microbiología Aplicada, una de las primeras derivaciones prácticas no empíricas emanadas de la Biología. A finales del siglo XIX eminentes biólogos como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad en industrias y destilerías.
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Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el micólogo Brefeld, logró aislar esporas de hongos y cultivarlas sobre medios sólidos a base de gelatina. Por su menor tamaño, este método se hacía inviable para las bacterias, por lo que se recurrió a un método basado en diluciones: Lister, en 1878 realizó diluciones secuenciales de cultivos mixtos, hasta muestras en las que existía una sola célula, sirvió para confirmar la naturaleza “particulada” de los agentes de las fermentaciones. -
En 1872 el médico alemán C.J. Eberth consiguió aislar los bacilos filtrando sangre de animales carbuncosos. Pero fue Robert Koch (1843-1910), que había sido alumno de Henle, quien con su reciente técnica de cultivo puro logró, en 1876, el primer aislamiento y propagación in vitro del bacilo del ántrax (Bacillus anthracis), consiguiendo las primeras microfotografías sobre preparaciones secas, fijadas y teñidas con azul de metileno.
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Una importante faceta de la inmunología de la primera mitad del siglo XX fue la obtención de vacunas. Se lograron toxoides inmunogénicos a partir de toxinas bacterianas, en muchos casos por tratamiento con formol: toxoide tetánico (Eisler y Lowenstein, 1915) y toxoide diftérico (Glenny, 1921). En 1922 se desarrolla la vacuna BCG contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de Calmette-Guérin.