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Estudió ingeniería a los 14 años, luego biología y por último es aceptada en la Universidad de Roma, en la Escuela de Medicina. A pesar de que su padre se opuso al principio, se graduó en 1896 como la primera mujer médico en Italia.
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De un desafortunado romance con Giuseppe Montesano, psiquiatra y profesor suyo, nació su hijo Mario. La profunda desilusión que le causó el abandono del médico, llevó a María Montessori a afiliarse al movimiento feminista, del que fue representante a nivel nacional e internacional, y representó a Italia en los Congresos de Berlín (1896) y de Londres (1899).
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Se interesó por la educación de los niños con deficiencias mentales y aplicó métodos experimentales consiguiendo que estos niños aprendieran a leer y escribir. Desarrolló sus propios métodos. A través de su práctica profesional llegó a la conclusión de que los niños «se construyen a sí mismos» a partir de elementos del ambiente y, para comprobarlo, volvió a las aulas universitarias a estudiar psicología. En 1906, decidió hacerse cargo de 60 menores cuyos padres trabajaban.
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La Metodología Montessori comenzó en Italia en 1907
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Fue desarrollada por la Doctora María Montessori, a partir de sus experiencias con niños en riesgo social.
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Sus opiniones causaron tanta molestia en el régimen gobernante que a la doctora no le quedó otra alternativa que exiliarse. Abandonó Italia en 1933 al ser clausuradas sus escuelas y fue a Barcelona, donde estuvo viviendo un tiempo y luego se estableció en Holanda con su esposo y su hijo.
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Regresó a Italia en 1947 para ayudar a la reorganización de escuelas y reanudar las clases en la Universidad de Roma.
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En 1950 fue nombrada doctora honoris causa por la Universidad de Amsterdam. En tres oportunidades fue nominada para el Premio Nobel (1949, 1950 y 1951).
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Falleció en Holanda en 1952, a los 82 años de edad, pero su pensamiento sigue vivo en las muchas instituciones educativas alrededor del mundo que aplican su método.