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(architetti Antonio da Sangallo il Vecchio e Baldassarre Peruzzi, al cui intervento si deve il cortile maggiore)
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La famiglia Altemps acquista il Palazzo.
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Il figlio naturale di Marco Sittico, Roberto, prefetto delle armi papali in Avignone sotto Sisto V Peretti e primo duca di Gallese, fu accusato di adulterio e fatto decapitare a 20 anni, proprio da Sisto V, per aver sposato una degli Orsini, suoi nemici giurati.
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Qualche papa dopo, Clemente VIII Aldobrandini, nel 1604, donò alla famiglia le spoglie di papa Aniceto per arricchirne la cappella privata, ma a memoria imperitura del sopruso, il figlio Giovanni Angelo Altemps secondo duca di Gallese fece dipingere nella stessa cappella del palazzo, nel 1617, un grande affresco che riproduceva la decapitazione del padre. È a Giovanni Angelo che si deve il primo teatro (poi denominato Teatro Goldoni) costruito nel palazzo.
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L'Accademia dell'Arcadia è un'accademia letteraria fondata a Roma nel 1690 da Gian Vincenzo Gravina e da Giovanni Mario Crescimbeni coadiuvati nell'impresa anche dal torinese Paolo Coardi, in occasione dell'incontro nel convento annesso alla chiesa di San Pietro in Montorio di quattordici letterati appartenenti al circolo letterario della regina Cristina di Svezia, tra i quali gli umbri Giuseppe Paolucci di Spello, Vincenzo Leonio da Spoleto e Paolo Antonio Viti di Orvieto, i romani Silvio Stamp
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Il palazzo fu affittato come sede diplomatica francese dal cardinale Melchior de Polignac e fu sede di grande mondanità e lusso: vi si recitò tra l'altro Metastasio e vi suonò anche Mozart, durante il suo soggiorno romano.
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