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En octubre de 1469, Isabel de Castilla y Fernando de Aragón se casaron en Valladolid, pero su matrimonio no significó la unión política de lso reinos, sino solo su unión personal como reyes.
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Isabel de Castilla y Fernando de Aragón influyeron en la política Europea al frenar el poder de Francia mediante enlaces matrimoniales logrados con los casamientos de sus hijos con Inglaterra, Países Bajos, Austria y Portugal.
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Juana, la segunda hija de los Reyes Católicos, nació en 1479 y fue educada con esmero. Hablaba francés y latín y era apasionada por la música, tocando varios instrumentos. A los dieciséis años, sus padres la casaron con Felipe el Hermosos, de 18 años, hijo del Emperador Maximiliano de Austria y soberano de Flandes y Borgoña.
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La joven princesa partió hacia Flandes, donde, a pesar de no conocerse previamente, los novios se sintieron profundamente atraídos, anteponiendo sus sentimientos a los intereses políticos. La boda se celebró el 18 de octubre de 1496 y desde entonces vivieron en Gante y Bruselas. Juana tuvo dificultades para adaptarse al nuevo país y a las costumbres de la corte flamenca.
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El 25 de febrero de 1500, Juana dio a luz a su primer hijo varón, Carlos, quien recibió el título de duque de Luxemburgo como heredero del trono. Anteriormente nació Leonor (1498), seguida por Isabel (1501), Fernando (1503), María (1505) y la hija póstuma de su marido, Catalina (1507).
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Tras la muerte de los herederos de Castilla y Aragón (su hermano Juan en 1497, su hermana Isabel en 1498 y el hijo de esta, Miguel en 1500), Juana y Felipe llegaron a la Península en 1501 para ser reconocidos como herederos. Fueron recibidos por los Reyes Católicos en Toledo, donde el 22 de mayo de 1502, las Cortes de Castilla juraron a Juana como heredera y a Felipe como consorte. La misma ceremonia se realizó meses después en Zaragoza.
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El archiduque Felipe, extrañando Flandes, regresa rápidamente a su país, mientras Juana, ante la insistencia de su madre Isabel, permanece en Castilla, aunque disgustada por separarse de su esposo. Esta situación durará hasta 1504, cuando Juana, tras un enfrentamiento con su madre en el castillo de La Mota, se embarca hacia Flandes.
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El 25 de noviembre de 1504, muere la reina Isabel. En su testamento, nombra a su hija Juana como heredera y, en caso de no poder gobernar, por enfermedad o ausencia, su esposo Fernando asumiría la regencia. Las Cortes, reunidas en Toro en 1505, juraron a Fernando como regente de Castilla.
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En abril de 1506, Juana y Felipe llegan a España, descontentos con lo decidido en las Cortes de Toro. Felipe, con el apoyo de la alta nobleza castellana, consigue obtener la regencia (Tratado de Villafáfila). Fernando se retira a sus estados de Aragón, se casa con Germana de Foix y tiene un hijo que muere pocas horas después de nacer.
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Felipe murió en Burgos el 25 de septiembre de 1506. Se creó un consejo de regencia, presidido por el Cardenal Cisneros, que reclamó el regreso del rey católico. Así, Fernando asumió nuevamente la regencia en Castilla, que duró de 1507 a 1516.
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El 15 de febrero de 1509, la reina Juana fue llevada, junto a su hija Catalina, a Tordesillas (Valladolid), donde permaneció durante 46 años bajo la custodia de los marqueses de Denia.
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Tras la muerte de Fernando el Católico en 1516, su nieto Carlos fue nombrado heredero de todos los territorios. Mientras Carlos llegaba desde Flandes, el Cardenal Cisneros asumió la regencia. Juana, aún encerrada en Tordesillas, quedó al margen del poder y permaneció en el olvido hasta la Guerra de las Comunidades.
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Las Comunidades de Castilla, en su resistencia al absolutismo de Carlos I (1520-1522), se apoyaron en Juana, considerándola la legítima soberana de Castilla. Establecieron su sede en Tordesillas, pero finalmente fueron derrotados.
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Juana de Castilla fallece el 12 de abril de 1555 en Tordesillas (Valladolid). Tres años después, su hijo Carlos también morirá.