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Nació el 12 de agosto de 1911 en Santa María la Redonda, Ciudad de México. Fue el sexto de los 12 hijos del matrimonio de Pedro Moreno Esquivel, funcionario de correos, y Soledad Reyes Guízar. Cuatro de ellos murieron debido a mal parto. Residieron en el barrio de Santa María la Ribera en la Ciudad de México, y creció en el barrio bravo de Tepito.
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En 1928, entró en el Ejército Mexicano. El 23 de mayo de ese mismo año, su padre solicitó formalmente su baja, alegando que su hijo tenía 16 años y no 21, tal y como había señalado para alistarse.
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A finales de los años veinte comenzó a actuar en los locales de Ciudad de México y creó la imagen prototípica con la que se haría famoso. En 1930 era ya el cómico más famoso del paí
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En 1934 conoció a la actriz de origen ruso Valentina Subarev, con quien contrajo matrimonio y tuvo a su único hijo, Mario Arturo.
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En 1936, con el amplio bagaje acumulado durante su estancia en el circo de Jalapa, representando papelitos en pequeños montajes teatrales -excepcionalmente musicados al estilo del género chico- debutó en la película No te engañes corazón, a la que siguieron Así es mi tierra y Águila o sol (1937), El signo de la muerte (1939) y toda una serie de cortometrajes.
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En 1944 entró a formar parte del Sindicato de Trabajadores de la Industria Cinematográfica (STIC), fundado en 1919 con el nombre de Unión de Empleados Confederados del Cinematógrafo.
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Mario Moreno falleció el 20 de abril de 1993 en su domicilio de Ciudad de México, rodeado de sus familiares y sin sufrir. Un cáncer de pulmón, detectado mes y medio atrás, le obligó a pasar sus últimos días en cama.