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En octubre de 1469 se casaron, en Valladolid. Este matrimonio no supuso la unión de dos reinos, únicamente quedaron unidos en las personas de los reyes
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Isabel de Castilla y Fernando de Aragón influyeron en la política de Europa, neutralizando la supremacía de Francia. Por medio de los enlaces matrimoniales de sus hijos. Establecieron alianzas con Inglaterra, Países Bajos, Austria y Portugal.
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Juana nacida en 1479, hablaba francés y latín, y escribía sin la menor dificultad. Apasionada de la música, y la Corte se sentía orgullosa de la Infanta. A los dieciséis años, sus padres la desposaron con Felipe el Hermoso, de dieciocho años, hijo del Emperador Maximiliano de Austria y Soberano ya de Flandes y Borgoña por el fallecimiento de su madre.
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La princesa partió para Flandes. La boda se celebró el 18 de octubre de 1496, y desde entonces residieron en Gante y Bruselas. Juana encontró dificultades para adaptarse al nuevo país y a las costumbres de la corte flamenca.
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Juana y Felipe tuvieron seis hijos. El 25 de febrero de 1500 nació su primogénito varón, Carlos, heredero del trono como duque de Luxemburgo. Antes de él nació Leonor (1498), y posteriormente Isabel (1501), Fernando (1503), María (1505) y Catalina (1507), esta última nacida tras la muerte de su padre.
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Tras la muerte de los herederos de Castilla y Aragón, Juana y Felipe viajaron a la Península en 1501 para ser reconocidos como herederos. En 1502, las Cortes de Castilla y Aragón celebraron ceremonias en Toledo y Zaragoza, donde Juana fue jurada como heredera y Felipe como su consorte.
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El archiduque Felipe, añorando su vida en Flandes, decide regresar, mientras que Juana, por orden de su madre, la reina Isabel, permanece en Castilla. Sin embargo, en 1504, ignorando los consejos maternos, Juana se embarca hacia Flandes para reunirse con su esposo.
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Tras la muerte de la reina Isabel I de Castilla el 25 de noviembre de 1504, su testamento declaraba heredera a su hija Juana. Sin embargo, ante la posibilidad de que Juana no pudiera gobernar por enfermedad o ausencia, Isabel dispuso que su esposo, Fernando, asumiera la regencia. En 1505, las Cortes de Toro confirmaron a Fernando como regente de Castilla.
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Tras la muerte de Felipe en Burgos el 25 de septiembre de 1506, se formó un consejo de regencia liderado por el Cardenal Cisneros. Este consejo solicitó el regreso de Fernando el Católico, quien asumió nuevamente el gobierno de Castilla. Su segunda regencia en el reino duró desde 1507 hasta 1516.
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En abril de 1506, Juana y Felipe llegan a España, descontentos con lo establecido en las Cortes de Toro. Felipe, con el apoyo de la alta nobleza castellana, logra hacerse con la regencia mediante el Tratado de Villafáfila. Como consecuencia, Fernando el Católico se retira a Aragón y se casa con Germana de Foix, con quien tiene un hijo que fallece poco después de nacer.
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El 15 de febrero de 1509, la reina Juana fue trasladada junto a su hija Catalina a Tordesillas, en Valladolid. Allí pasó 46 años bajo la custodia de los marqueses de Denia.
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Tras la muerte de Fernando el Católico en 1516, su nieto Carlos heredó sus territorios, incluida la corona de Castilla. Mientras Carlos llegaba desde Flandes, el Cardenal Cisneros asumió la regencia. Juana, madre de Carlos y legítima heredera, permaneció recluida en Tordesillas, apartada del poder.
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Durante la revuelta de las Comunidades de Castilla (1520-1522) contra el absolutismo de Carlos I, los comuneros respaldaron a Juana la Loca como legítima soberana de Castilla. Establecieron su sede en Tordesillas, pero finalmente fueron derrotados.
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Juana de Castilla, conocida como Juana la Loca, falleció el 12 de abril de 1555 en Tordesillas (Valladolid), donde pasó gran parte de su vida recluida.