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Exploró el litoral de Colombia y Panamá. En 1500, asociado a Juan de la Cosa, organizó una expedición hacia el Nuevo Mundo; descubrió la desembocadura del río Magdalena y fundó el puerto de Darién (Cartagena de Indias). En 1524, contando con la autorización del emperador, se dirigió desde Santo Domingo a Tierra Firme, donde fundó la ciudad de Santa Marta, de la que fue gobernador.
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En 1509, Alonso de Ojeda solicitó sus servicios para explorar las costas del Darién. En Cartagena de Indias, Martín Fernández de Enciso rescató a la malograda expedición de Ojeda y fundó, junto con Vasco Núñez de Balboa, la ciudad de Santa María la Antigua. En sus viajes realizó una importante labor cartográfica.
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Hacia finales de 1509, llegó al Urabá-Darién en calidad de gobernador de la provincia de Nueva Andalucía, la cual comprendía la región del Urabá-Darién. Comandaba una expedición que partió de Santo Domingo, compuesta por 300 hombres, con la que fundó este asentamiento de San Sebastián de Urabá, cerca a la actual localidad de Necoclí, Antioquia.
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El mes de septiembre de 1513. Vasco Núñez de Balboa y 190 hombres parten del Darién en dirección a Careta, región caribeña cuyo cacique era aliado de los españoles y en donde se unieron mil nativos más.
Con este importante descubrimiento, que algunos consideran el segundo hecho más importante sólo por debajo del descubrimiento de América del año 1492, quedaba abierta la nueva ruta hacia la conquista del Perú, uno de los hitos de la conquista española de América. -
Pedro de Heredia llegó a la ciudad india de Calamar (que es ahora el centro histórico) en busca de un lugar donde hubieran corrientes de agua para poder establecerse. Se vivieron difíciles encuentros con los autóctonos y Heredia exploró las tierras circundantes para fundar finalmente la ciudad de Cartagena de Poniente (Cartagena del oeste) para diferenciarla de Cartagena de Levante (Cartagena del este) en España.
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El 25 de julio de 1536 Belalcázar funda Santiago de Cali, inicialmente establecida al norte de la posición actual cerca de Vijes y Riofrío. Bajo órdenes de Belalcázar el capitán Miguel Muñoz reubicó la ciudad al lugar actual, donde el capellán Fray Santos de Añasco celebró una misa en el lugar hoy ocupado por la Iglesia de la Merced. Belalcázar designó como primera autoridad municipal a Pedro de Ayala.
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En abril de 1536 Gonzálo Jiménez de Quesada partió desde Santa Marta hacia el interior, en busca del mítico tesoro el Dorado.
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El 13 de enero de 1537, el Adelantado Sebastián de Belalcázar fundó la ciudad de Asunción de Popayán, más conocida como Popayán. Asunción de Popayán, capital del departamento del Cauca, es una de las ciudades más antiguas y mejor conservadas de América.
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En 1537 Quesada llego al Valle de los Alcazares (sabana de Bogotá), desde donde dirigió otras expediciones para contactar y someter a los zipas de Teusacá y Tunja. el 6 de agosto de 1538, fundó la ciudad de Santa fe de Bogotá.
