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Se casaron en Valladolid. El matrimonio no supuso la unión de los reinos, solo de los reyes como personas.
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Fue la segunda hija de los RR.CC. Recibió una educación muy completa y hablaba varios idiomas. Le gustaba la música y tocaba varios instrumentos. A los 16 años sus padres la desposaron con Felipe el Hermoso.
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Se conocieron en Flandes y desde el principio se sintieron muy atraidos. Desde que se casaron residieron en Gante y Bruselas.
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Fue el primer hijo varón del matrimonio, por lo que adquirío el título de heredero del trono. Anterior a él, se encontrnaba su hermana Leonor quién nació en 1948. Después nacieron Isabel (1501), Fernando (1503), María (1505) y Catalina (1507).
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Tras la muerte sucesiva de todos los herederos de Castilla y Aragón: su hermano Juan (1497), su hermana Isabel (1498), y el hijo de esta, Miguel (1500); Juana es jurada como heredera de la corona y como consorte se reconoce al archiduque Felipe.
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Felipe al no encontrarse agusto en Castilla decide regresar a Flandes, y Juana se queda obedeciendo a las ordenes de su madre. En 1504, Juana decide viajar a Flandes sin hacer caso a los consejos de su madte.
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Tras la muerte de la reina Isabel, y como se establece en su testamento, Juana es nombrada heredera y en caso de no poder gobernar D. Fernano será encargado de la regencia. En 1505 las Cortes, reunidas en Toro, juran a Fernando como regente del reino de Castilla.
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Dado que Juana y Felipe no estaban conformes con lo que las cortes habían establecido, ya que Felipe deseaba la regencia, este se apoya en la alta nobleza castellana para conseguirlo. Tras lograrlo en el Tratado de Villafáfila, Fernando se retira a Aragón.
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Felipe muere en Burgos, y ante esto se forma un consejo de regencia. En el mismo se reclamó la vuelta del rey católico, lo que llevó a la segunda regencia de Fernando la cual duró 9 años (1507-1516)
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La reina Juana y su hija Catalina fueron trasladadas a Tordesillas (Valladolid), donde vivió 46 años custodiada bajo los marqueses de Denia.
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Con su muerte, Fernando el Católico deja como heredero de sus estados patrimoniales y de la corona a su nieto Carlos, hijo de Juana y Felipe. Hasta la llegada del nuevo rey, asume la regencia Cardenal Cisneros.
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Las Comunidades de Castilla se oponen al absolutismo monárquico de Carlos I (1520-1522). Los comuneros se apoyan en Juana y comienzan a considerarla la legitima soberana, por lo que establecen su sede en Tordesillas. Finalmente son derrotados.
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Juana muere en Tordesillas (Valladolid) el 12 de abril de 1555.