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Apenas a sus 17 años, se trasladó a los Paises Bajos para contraer matrimonio con el archiduque e Austria, heredero de las casas de Borgoña y Habsburgo.
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En Octubre su hermano mayor Juan, falleció a los 19 años, según se dijo por sus ecesos sexuales con su jóven esposa Margarita de Austria
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La otra hermana mayor de Juana, falleció un año después que su hermano.
El hijo de Juana recién nacido Miguel, quedaba como heredero de España y Portugal, pero murió antes de su segundo cumpleaños -
Debido a estos sucesos, Juana se convirtió en la única heredera de las coronas de Catilla y Aragón. Por lo que su madre le imploró que regresara a España
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Enviadopor los Reyes Católicos como embajador a Flandes, informaba de que era "habida por muy cuerda y por muy asentada". Ese mismo año, el embajador residente de España había llegado a decir que "en persona de tan poca edad no creo que se haya visto tanta cordura".
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Las Cortes de Toledo reunidas en mayo marcaron un punto de inflexión en la vida pública de Juana, pues fue entonces cuando empezó a ponerse en cuestión su idoneidad para gobernar.
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La reina Isabel redactó un último testamento poco antes de su muerte, existían serias dudas en torno a la salud mental de Juana. Aunque Isabel la confirmó como heredera de sus reinos, en el documento añadía que si la reina Juana, "estando en ellos, no quiera o no pueda entender en la gobernación dellos", sería Fernando quien ejercería la regencia en su nombre.
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Su esposo y ella habían vuelto a España, un año y cuatro meses después del fallecimiento de Isabel la Católica.
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Felipe le comunicó que lo había firmado con su padre en la que se estipulaba que si la nueva reina no quería o no estaba en condiciones de gobernar, Felipe asumiría total autoridad y hasta continuaría siendo rey a la muerte de su esposa.
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Su muerte repentina supuso sin duda un tremendo golpe emocional para Juana, embarazada de su sexto hijo.
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Tras la breve regencia del cardenal Cisneros, el primogénito de Juana, Carlos, sería proclamado rey sin atender a los derechos dinásticos de su madre, que quedaría confinada en el castillo-palacio de Tordesillas
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Durante cuatro años no informaron a Juana de que su padre había fallecido. Denia apartó a la infanta Catalina del cuidado de su madre, y dos años después se llevó en secreto el ataúd de Felipe el Hermoso para sepultarlo en la Capilla Real de Granada.
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Francisco de Borja, jesuita y antiguo conde de Gandía, fue enviado a Tordesillas por el futuro Felipe II con la misión de averiguar el porqué de su negativa a ir a la iglesia.
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Murió el Viernes Santo de 1555, a los 76 años, tras haber permanecido confinada casi medio siglo.
Francisco de Borja atestiguó que sus últimas y balbuceantes palabras habían sido "Jesucristo crucificado, ayúdame". Juana luchó durante toda su vida para ser una buena hija, esposa y madre. Aceptó que enfermaba con frecuencia y que, cuando eso ocurría, era incapaz de gobernar sus múltiples reinos.