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En octubre de 1469 se casaron en Valladolid. Esto no supuso que Castilla y León se unifican, sino que se quedan como reinos separados.
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Isabel de Castilla y Fernando de Aragón impactaron la política europea al frenar el dominio de Francia. A través de los matrimonios de sus hijos, rodearon dicho reino y forjaron alianzas estratégicas con Inglaterra, los Países Bajos, Austria y Portugal.
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Juana, la segunda hija de los Reyes Católicos, nació en 1479 y recibió una educación distinguida. Dominaba el francés y el latín, escribía con facilidad y destacaba por su pasión por la música, tocando varios instrumentos. A los 16 años, sus padres la casaron con Felipe el Hermoso, hijo del emperador Maximiliano de Austria y gobernante de Flandes y Borgoña tras la muerte de su madre.
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La joven princesa viajó a Flandes para conocer a su futuro esposo. Aunque nunca se habían visto antes, la atracción entre ambos fue inmediata, superando cualquier interés político. La boda tuvo lugar el 18 de octubre de 1496, y desde entonces vivieron en Gante y Bruselas. Sin embargo, Juana enfrentó dificultades para adaptarse a la cultura y las costumbres de la corte flamenca.
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El 25 de febrero de 1500 nació su primer hijo varón, Carlos, quien fue nombrado duque de Luxemburgo como heredero al trono. Antes que él, en 1498, había nacido Leonor, y posteriormente llegaron Isabel (1501), Fernando (1503), María (1505) y, tras la muerte de su padre, Catalina en 1507.
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Tras la muerte sucesiva de los herederos al trono de Castilla y Aragón—su hermano Juan (1497), su hermana Isabel (1498) y el hijo de esta, Miguel (1500)—, Juana y Felipe viajaron a la península en 1501 para ser reconocidos como sucesores. Fueron recibidos por los Reyes Católicos en Toledo, donde, el 22 de mayo de 1502, las Cortes de Castilla juraron a Juana como heredera y a Felipe como su consorte. Meses después, la misma ceremonia tuvo lugar en Zaragoza.
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El archiduque, incómodo con el clima y las costumbres de Castilla, decidió regresar pronto a Flandes. Sin embargo, la reina Isabel insistió en que Juana permaneciera en Castilla, lo que la afectó profundamente al verse separada de su esposo. La distancia entre ambos se prolongó hasta 1504, cuando Juana, ignorando las advertencias de su madre, decidió embarcarse rumbo a Flandes.
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El 25 de noviembre de 1504 falleció la reina Isabel, dejando en su testamento a su hija Juana como heredera. Sin embargo, si esta no podía gobernar por enfermedad o ausencia, la regencia recaería en Fernando. En 1505, las Cortes reunidas en Toro ratificaron a Fernando como regente de Castilla.
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En abril de 1506, Juana y Felipe regresaron a España, inconformes con lo establecido en las Cortes de Toro. Felipe, con el respaldo de la alta nobleza castellana, logró asumir la regencia mediante el Tratado de Villafáfila. Ante esta situación, Fernando se retiró a Aragón, donde contrajo matrimonio con Germana de Foix, con quien tuvo un hijo que falleció pocas horas después de nacer.
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Felipe falleció en Burgos el 25 de septiembre de 1506. Tras su muerte, se estableció un consejo de regencia encabezado por el Cardenal Cisneros, que solicitó el regreso de Fernando. Así, el rey católico asumió nuevamente la regencia de Castilla, la cual se extendió desde 1507 hasta 1516.
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El 15 de febrero de 1509, la reina Juana fue llevada a Tordesillas (Valladolid) junto a su hija Catalina. Permaneció allí bajo la custodia de los marqueses de Denia durante 46 años.
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Tras la muerte de Fernando el Católico en 1516, su nieto Carlos, hijo mayor de Juana y Felipe, heredó sus territorios y la corona de Castilla. Mientras Carlos permanecía en Flandes, el Cardenal Cisneros asumió la regencia. Juana, recluida en Tordesillas, quedó al margen de los asuntos de Estado, envuelta en el misterio y la leyenda.
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Durante la revuelta de las Comunidades de Castilla (1520-1522) contra el absolutismo de Carlos I, la figura de Juana recobró relevancia. Los comuneros la consideraban la legítima soberana y establecieron su sede en Tordesillas. Sin embargo, el movimiento fue sofocado y la rebelión terminó en derrota.
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Juana de Castilla muere el día 12 de abril de 1555 en Tordesillas (Valladolid).