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El 13 de agosto de 1521 Cuauhtémoc fue capturado, lo que significó la definitiva caída de Tenochtitlán en manos de los españoles. A partir de esta fecha inicia el periodo de la historia de México conocido conocida como la colonia que dura tres siglos de 1521 a 1821
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En 1521 Alonso de Avalos llegó a esta zona por el rumbo de Mazamitla. Los señoríos de la región, esperando sacudirse el yugo colimote, lo recibieron en paz; una Real Cédula del 22 de diciembre de 1522 dice que Don Alonso de Avalos fundó la ciudad de "Sayula como capital de la Provincia de Avalos".
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° A la llegada de Nuño de Guzmán a Pánuco —actual estado de Veracruz— el 24 de mayo de 1527, la única villa española que existía era “Santisteban del Puerto”, inmediatamente a su llegada, Guzmán comenzó a aplicar una serie de medidas de reorganización, con el fin de limitar las medidas y el poder de Hernán Cortés. En su administración también se levantó el primer faro de la población y se "pacificaron" y conquistaron una serie de poblados de indios aledaños. Introdujo asimismo yeguas a la zona.
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° A partir de 1528, Nuño de Guzmán recibió instrucciones del rey de iniciar un juicio de infidencia contra Cortés. En 1529 comenzó el juicio de residencia contra Cortés debido a presiones de la audiencia, el motivo: la muerte de su esposa Catalina Xuárez Marcaida, ya que se lo acusaba de haberla asesinado.
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Nuño de Guzmán consiguió permiso para explorar las tierras occidentales del actual México, aún sin explorar, y montó una expedición con unos 300 españoles, algo más de 6 mil indios auxiliares y cañones, ya que nuestro protagonista tenía una gran rivalidad con Hernán Cortés, el cual se encontraba en Castilla resolviendo asunto referentes a su gobernación. Nuño pretende aprovechar la ausencia de su enemigo para intentar arrebatarle sus territorios.
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Nuño Beltrán era rival del conquistador Hernán Cortés. Salió de la cuidad de México con un ejercito compuesto por 300 españoles y 10 000 mexicanos, otomíes, tlaxcaltecas y tarascos. Nuño iba en busca del reino de las amazonas que se suponía encontrarse en el noroeste, por la actual Sinaloa. Nuño amplió sus dominios y organizó una exploración a los estados actuales de Nayarit, Jalisco, Colima, Aguascalientes y parte de Sinaloa, Zacatecas y San Luis Potosí.
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En recuerdo de la ciudad de Santiago de Compostela de España y en cumplimiento de una real cédula dada en Ocaña el 25 de enero de 1531 por la reina de España doña Juana de Castilla, en enero de 1532 Nuño de Guzmán funda en Tepic la nueva ciudad de Santiago de Compostela como la capital de la Nueva Galicia
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En 1530 Nuño Beltrán de Guzmán se propuso conquistar la región, entró por La Barca hacia Tonallan, acompañado por 500 soldados españoles y 15 mil indígenas. Una vez logrado el objetivo, decidió llamar Guadalajara a las tierras conquistadas, en honor a la ciudad española donde nació y establecer ahí una ciudad en la que pudiera mantener el control de estos territorios. La primera fundación de Guadalajara sucedió en 1532 en Nochistlán.
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La Guerra del Mixtón (1532- 1541) fue una serie de enfrentamientos bélicos entre varias tribus indígenas —denominadas de forma genérica chichimecas— pertenecientes a la audiencia de Nueva Galicia, al poniente de la Nueva España, que se sublevaron contra el ejército español a mediados del siglo XVI. Durante esa época, varios pueblos indígenas ya habían sido conquistados previamente por los españoles, pero unidos rehusaron el sometimiento y se levantaron en armas.
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Durante la dominación española Tonallán fue nombrada como corregimiento del reino de la Nueva Galicia con el nombre de Santiago de Tonalá. Por aproximadamente 18 meses, Tonalá fue el segundo asentamiento de la trashumante Guadalajara, dicha villa se asentó en este lugar del 8 de agosto de 1533 hasta febrero de 1535.
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La tercera fundación de Guadalajara ocurrió en 1535 en la región de Tlacotán, sin embargo, los colonos fueron continuamente atacados por los indígenas de la región, orillándolos a buscar una nueva ubicación para la ciudad
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El 14 de febrero de 1542, la ciudad de Guadalajara fue fundada por cuarta y última vez en el Valle de Atemajac, sobre el margen del río San Juan de Dios. Los primeros habitantes de Guadalajara fueron españoles peninsulares e indígenas, se calcula que la población inicial de la ciudad fue de aproximadamente 300 habitantes.