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El 13 de agosto de 1521 Cuauhtémoc fue capturado, lo que significó la definitiva caída de Tenochtitlán en manos de los españoles.
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Gonzalo de Sandoval rodeó el lago de Chapala por el sur, llegó a Colima y el 25 de julio de 1523 fundó la villa de Santiago de los Caballeros.
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Hacia 1524, Alonso de Ávalos llegó al sur de Jalisco y se quedó con la encomienda más tarde conocida como Provincia de Ávalos.
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Pero la conquista y la colonización definitivas de estas tierras fueron emprendidas en diciembre de 1529 por el licenciado Nuño Beltrán de Guzmán. Al frente de trescientos españoles, de siete a ocho mil indios y con doce piezas de artillería, el “muy magnífico señor” –título que le correspondía como presidente de la Real Audiencia– Nuño Beltrán de Guzmán partió de la Ciudad de México, y pasó por Tzintzuntzan hacia los actuales territorios de Jalisco.
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El 24 de marzo de 1530 fue recibido pacíficamente por la hueytlatoani Itzcapilli Tzapotzinco. Fue atacado, empero, por los disidentes, y tras una dura batalla que fue ganada –a decir de los españoles– con la ayuda del apóstol Santiago el Mayor, se posesionó de Tonalá y de las poblaciones aledañas.
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Se fundaron las villas de San Miguel-Culiacán, Chiametla, Compostela, Purificación y Guadalajara, a las que sumó su gobernación del Pánuco, a todo lo cual denominó la Conquista del Espíritu Santo de la Mayor España. Pero el 25 de enero de 1531, desde Ocaña, la emperatriz Isabel –en ausencia del emperador Carlos I– expidió una real cédula en la cual le ordenó que cambiara el nombre de la Conquista de la Mayor España por el de Reino o Provincia de la Nueva Galicia,
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El viernes 5 de enero de 1532 el capitán Juan de Oñate, por órdenes de Nuño de Guzmán, fundó la villa de Guadalajara en Nochistlán, en la región cazcana, dándole este nombre en honor de la patria del conquistador.
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En mayo de 1533, Nuño de Guzmán visitó la villa de Guadalajara y consideró las difíciles condiciones de vida de los colonos. Los comisionados sugirieron el poblado de Tlacotlán, lo cual aprobó el conquistador.
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Los colonos hicieron caso omiso de la condición, y hacia Agosto de 1533 atravesaron la barranca y se establecieron en el valle de Tonalá.
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Nuño de Guzmán ordenó en febrero de 1536 que, de acuerdo con lo convenido, Guadalajara se trasladara a Tlacotlán, casi al borde de la barranca, como en efecto aconteció.
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A finales del citado 1536,Nuño Beltrán de Guzmán partió a la Ciudad de México donde fue encarcelado y más tarde se le condujo a España, donde enfrentó el juicio de residencia,
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La villa de Guadalajara, mediante dos cédulas reales del emperador Carlos I, fue elevada al rango de ciudad y se le concedió su escudo de armas. Las cédulas se expidieron el 8 de noviembre de 1539 y llegaron a su destino en agosto de 1542.
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La rebelión obligo al gobernador de la Nueva Galicia, Cristóbal de Oñate, a pedir ayuda al virrey Antonio de Mendoza, quien le envió refuerzos y ordenó a Pedro de Alvarado que acudiese a auxiliar a la región. Pero éste, subestimando la magnitud de la rebelión, fue derrotado y herido accidentalmente en la huida
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La novel ciudad, empero, sufría la rebelión de los cazcanes acaudillados por Tenamaztle quienes, aliados a los tecuejes y los zacatecos, pusieron en peligro toda la conquista hispánica.
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el 30 de septiembre de 1541 Cristóbal de Oñate convocó a sesión al Cabildo de la ciudad, para discutir el traslado al valle de Atemajac, lo cual se aprobó. Así, Guadalajara se estableció en el valle de Atemajac en febrero de 154
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Tras ser herido en la rebelión Pedro Álvarado falleció el 4 de julio de 1541.
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Ante el enérgico ataque indígena–víspera de la fiesta de san Miguel Arcángel–, Guadalajara estuvo a punto de desaparecer, al grado de que los españoles atribuyeron su salvación al auxilio celestial del apóstol Santiago Matamoros y de san Miguel, a quien nombraron patrono de la ciudad.
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En tanto el virrey Antonio de Mendoza, alarmado por la inconcebible muerte de Pedro de Alvarado, al frente de un ejército que sobrepasaba los cincuenta mil indios –nahuas y purépechas– y algunos centenares de españoles,se trasladó a la Nueva Galicia para emprender una demoledora campaña contra los indios insurrectos, que culminó con el sitio y la toma del peñol del Miztón, el 16 de diciembre de 1541.
