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En 1469, se casarón en Valladolid los Reyes Católicos; Isabel de Castilla y Fernando de Aragón. No supuso la unión de dos reinos
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Hablaba en Francés e Inglés, y escribía sin la menor dificultad. Tocaba diversos instrumentos. A los 16 años, sus padres la desposaron con Felipe el Hermoso Soberano de Francia y de Borgoña.
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Los Reyes influyeron en la política de Europa neutralizando la supremacía de Francia, por medio de los enlaces matrimoniales de sus hijos establecieron alianzas con Inglaterra, Países Bajos, Austria y Portugal.
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La princesa parte para Flandes, aunque no se conocían tenían sentimientos entre ellos. Desde que se casaron residieron en Gante y Bruselas. Juana encontró dificultades para adaptase a un nuevo país y a las costumbres de la corte flamenca.
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Es el primer hijo varón y se le dio el nombre de Carlos Duque de Luxemburgo. Antes había nacido su hermana Leonor, los demás hermanos se llamaban Isabel, Fernando, María y Catalina, esta última era hija póstuma del marido de Juana.
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Al morir sucesivamente los herederos de Castilla y Aragón vienen a la península para ser reconocidos como tales. Son recibidos por los Reyes Católicos, reunidas las cortes en Castilla en 1502, el 22 de mayo. Hacen heredera a Juana y a Felipe consorte.
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El archiduque regresa a Flandes y Juana se queda en Castilla ante la insistencia de su madre, pero muy disgustada por separase de su esposo. Esta separación durará hasta 1504, cuando Juana se enfrenta a su madre en el Castillo de la Mota y se embarca a Flandes.
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En su testamento nombraba heredera a su hija, pero en caso de ausencia o enfermedad nombraba como Regente a Don Fernando. En 1505 las cortes reunidas en Toro, juraron a Fernando como regente del reino de Castilla.
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No conformes con lo acordado en las cortes de Toro, vienen a España en abril de 1506. Felipe consigue la regencia en el Tratado de Villafáfila. Después Fernando se retira a sus estados de Aragón y se casa con Germana de Fuix, con la que tuvo un hijo que murió a las pocas horas.
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Fue trasladada con su hija a Tordesillas, Valladolid. Allí vivió 46 años, bajo la custodia de los Marqueses de Denia.
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Al morir se formo un consejo de regencia presidido por el Cardenal Cisneros que reclamo la vuelta del Rey Católico.
Esta segunda regencia, de Fernando duró de 1507 a 1516. -
Deja de heredero a su nieto Carlos, heredero también de la corono de Castilla hasta la llegada del nuevo rey, este se encontraba en Flandes. Asumió la regencia el Cardenal Cisneros. Juana sigue encerrada en Tordesillas hasta la Guerra de las Comunidades.
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La resistencia que van a oponer las Comunidades de Castilla al absolutismo de Carlos I, hace que la reina vuelva a adquirir importancia, porque la considera la legítima soberana de Castilla.
Los Comuneros establecen su sede en Tordesillas pero finalmente son derrotados. -
Muere en Tordesillas, su hijo Carlos morirá 3 años más tarde.