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Isabel de Castilla y Fernando de Aragón se desposaron el 19 de octubre de 1469 en el Palacio de los Vivero (Valladolid). La ciudad fue testigo de la boda que puso la primera piedra de la construcción de España como nación.
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Nació en Toledo el 6 de noviembre de 1479 y fue bautizada con el nombre del santo patrón de su familia, al igual que su hermano mayor, Juan.
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La boda se celebró formalmente, por fin, el 20 de octubre de 1496 en la iglesia colegiata de San Gumaro de la pequeña ciudad de Lier, gracias a la influencia de la familia Berghes. El obispo de Cambrai, que posteriormente sería el líder de la facción españolista, Enrique de Bergen, realizó la ceremonia oficial de la boda.
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El 15 de noviembre de 1498, en la ciudad de Lovaina (cerca de Bruselas), nació su primogénita, Leonor, llamada así en honor de la abuela paterna de Felipe, Leonor de Portugal.
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El 24 de febrero de 1500, asistió a una fiesta en el palacio de Gante. Aquel mismo día tuvo a su hijo, según se dice, en un retrete del palacio.
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El 10 de marzo de 1503, en la ciudad de Alcalá de Henares, dio a luz un hijo al que llamó Fernando en honor a su padre, Fernando el Católico.
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Al año siguiente, el 18 de julio de 1501, en Bruselas, nació una hija, llamada Isabel en honor de la madre de Juana, Isabel la Católica.
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Tras el parto, y con sus tres hijos mayores en Bruselas, Juana volvió a pedir autorización para regresar a Flandes, pero su madre se opuso. La guerra con Francia convertía en inviable el camino por tierra. Ante la insistencia de Juana, Isabel ordenó al obispo Fonseca que recluyera a su hija en el castillo de la Mota. Madre e hija terminaron en disputa y, al final, Isabel consintió que Juana regresase a Flandes, donde llegó en junio de 1504.
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La reina Isabel murió el 26 de noviembre de 1504, planteándose el problema de la sucesión en Castilla. Según el historiador Gustav Bergenroth, su madre desheredó a Juana en su testamento porque no iba a misa ni quería confesarse. Sin embargo, su padre, Fernando, la proclamó reina de Castilla y siguió él mismo gobernando el reino.
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Juana y Felipe, no conformes con loa cordado en las Cortes de Toro, vienen a España en abril de 1506. Felipe desea la regencia y, apoyándose en la alta nobleza castellana, lo consigue (Tratado de Villafáfila).
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El marido de Juana, el archiduque Felipe, no estaba dispuesto a renunciar al poder, y en la concordia de Salamanca (1505) se acordó el gobierno conjunto de Felipe, Fernando el Católico y la propia Juana.
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Felipe murió en Burgos el 25 de Septiembre de 1506. Se formó un consejo de regencia que, presidido por el Cardenal Cisneros, reclamó la vuelta del rey católico. Esta segunda regencia de Fernando en Castilla duró nueve años (1507-1516)
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El 15 de febrero de 1509, la reina Juana fue trasladada con su hija Catalina a Tordesillas. Allí vivió 46 años bajo la custodia de los marqueses de Denia.
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Al morir Fernando el Católico en 1516, deja como heredero de sus estados patrimoniales a su nieto Carlos, primogénito de Juana y Felipe, heredero también de la corona de Castilla. Hasta la llegada del nuevo rey, asume la regencia el Cardenal Cisneros. Juana I de Castilla permanece encerrada en Tordesillas.
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Las Comunidades de Castilla oponen resistencia al absolutismo monárquico de Carlos I (1520-1522). A partir de este suceso, vuelve a cobrar relevancia la figura de la reina. Juana es apoyada por los comuneros, quienes la consideran soberana de castilla. Los comuneros establecen su sede en Tordesillas, pero finalmente son derrotados.
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Juana de Castilla muere el día 12 de abril de 1555 en Tordesillas (Valladolid).