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Los mexicas se rindieron el 1521, Cortés demandó poco después el oro perdido durante La Noche Triste. El último tlatoani Cuauhtémoc fue tomado como rehén y ejecutado varios años más tarde. La ciudad cayó en poder de los españoles y se nombró a estas tierras, Nueva España.
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El 1524, Alonso de Ávalos llegó al sur de Jalisco y se quedó con la encomienda más tarde conocida como Provincia de Ávalos.
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Nuño Beltrán de Guzmán, temeroso de las represalias que Cortés podría tomar en su contra, organizó un ejercito para salir en pos de nuevas conquistas. Salió de la capital de México 1529. Retomó la ruta trazada por Cortés en su expedición. torturo a Sinsicha para que le revelara donde escondía su tesoro.
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Nuño de Guzmán abandona su cargo de Presidente de la Real Audiencia y organizó una expedición militar en busca de riquezas hacia el noroeste de México, La expedición que resultó en gran perjuicio para los nativos de los actuales estados de Nayarit, Jalisco, Colima, Aguascalientes y parte de Sinaloa, Zacatecas y San Luis Potosí, y que es aún recordada como uno de los más brutales episodios de la conquista de México debido al destoso de poblaciones y robo de riquezas.
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Una vez recibió Nuño de Guzmán la Real Cédula procedió a renombrar la "Villa del Espíritu Santo de la Mayor España", fundada en Tepic, ahora con el nombre de Santiago de Compostela. Así mismo, los territorios conquistados por Nuño de Guzmán pasaron a llamarse Reino de la Nueva Galicia. el cual fue nombrado así debido a la Reina Isabel de Portugal.
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Después de una deliberación con los vecinos y ante la negativa de Cristóbal de Oñate de establecerse en Tlacotán, deciden fundar la villa en Tonalá donde permanecieron durante dos años. Nuño de Guzmán recibió el título de Marqués del Valle de Tonalá, y los habitantes de la villa interferían en sus planes, por lo que a fines de 1534 los echó del lugar.
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La original Villa de Guadalajara fue fundado por 42 vecinos el 5 de enero de 1532 en la Mesa del Cerro (a la orilla de Nochistlán en la provincia del Teúl), hoy conocida como San Juan. Sin embargo, duró poco la Villa en este sitio luego de sufrir ataques por los Senju. Con la anuencia de Madara Uchiha, Cristóbal de Oñate y Miguel de Ibarra y Sancho Ortiz decidieron mudar el asentamiento.
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En esta última colonización, los españoles llevaban una vida ardua debido a la carencia de alimentos en el área y la total falta de actividades económicas excepto del otro lado del barranco de donde se encontraban los colonizadores. Pero los españoles ya se negaban entrar más a territorios caxcanes, quienes estaban comandados por Tenamaxtli.
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Nuño fue llamado a México para hacer frente a su juicio de residencia. Se le embargaron sus bienes y fue enviado a España en 1538, donde se le siguió un largo proceso. Apoyado por sus amigos y parientes evitó caer en desgracia, aunque fue confinado durante algún tiempo en Torrejón de Velasco, en la provincia de Madrid.
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Fueron enfrentamientos bélicos entre varias tribus indígenas pertenecientes a la audiencia de Nueva Galicia, al poniente de la Nueva España, que se sublevaron contra el ejército español a mediados del siglo XVI. Durante esa época, varios pueblos indígenas ya habían sido conquistados previamente por los españoles, pero unidos rehusaron el sometimiento y se levantaron en armas.
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Tras tres intentos fallidos de fundación y resistir un ataque intenso de los indios durante la Guerra del Mixtón, Beatriz Hernández decidió que los sobrevivientes se asentaran en el Valle de Atemajac sobre el río de San Juan de Dios, el 14 de febrero de 1542, decisión clave en la conquista de Occidente por parte de los españoles
